神经肽介导 cGAS-STING 通路调控炎症与铁死亡缓解结肠炎
一、文献背景介绍
该研究相关论文于 2024 年正式发表于《International Journal of Biological Sciences》（国际生物科学杂志，简称 Int. J. Biol. Sci.）。本研究由中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全国家重点实验室团队完成，论文标题为Neuropeptide substance P attenuates colitis by suppressing inflammation and ferroptosis via the cGAS-STING signaling pathway（神经肽 P 物质通过 cGAS-STING 信号通路抑制炎症与铁死亡进而缓解结肠炎）。炎症性肠病作为一类病因尚未完全阐明的慢性肠道疾病，溃疡性结肠炎长期迁延会提升结肠癌发病风险，现有临床药物存在副作用明显、疗效短暂等局限，同时肠神经系统在肠道稳态调控中的作用逐渐受到学界关注，而神经肽 P 物质（SP）在肠道炎症中的作用存在争议，其与 cGAS-STING 天然免疫通路、铁死亡的关联机制也尚未明确，这也是本研究开展的核心行业与学术背景。
二、摘要核心内容解读
本研究以葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型及肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）刺激的人结肠腺癌细胞 Caco-2 体外炎症模型为研究载体，首先证实 DSS 诱导的结肠炎病灶中 SP 阳性神经元被显著激活，组织内 SP 表达水平同步上调；外源性补充 SP 能够有效改善结肠炎小鼠的临床病症、修复受损肠道屏障并抑制肠道炎症反应，机制层面上 SP 可保护线粒体免受 DSS 与 TNF-α 的损伤，阻断线粒体 DNA（mtDNA）向胞质渗漏，以此抑制 mtDNA 介导的 cGAS-STING 信号通路活化，同时 SP 可借助神经激肽 1 受体（NK1R）直接阻碍 STING 磷酸化，进而下调下游 TBK1-IRF3 信号轴的激活状态，研究还明确 SP 能够通过靶向 cGAS-STING 通路缓解 DSS 与 TNF-α 诱导的肠道上皮细胞铁死亡，而 NK1R 抑制剂可逆转 SP 对炎症及铁死亡的抑制效应；整体研究完整阐释了 SP 依赖 NK1R，通过调控 mtDNA-cGAS-STING 通路以及直接作用于 STING 靶点双重方式抑制炎症与铁死亡，最终发挥抗结肠炎作用的分子机制，为溃疡性结肠炎的靶向干预提供了全新的理论依据与作用靶点。
三、整体研究思路与实验结果深度解析
本研究采用体内动物模型 + 体外细胞模型相结合的研究方案，从表型验证、功能探究、机制解析、通路验证、受体验证逐层开展实验，各部分结果解析如下：
（一）结肠炎模型中内源性 SP 表达与神经元活化
研究构建 4% DSS 饮水诱导的小鼠急性结肠炎模型，检测结肠组织中 SP 的表达与定位。结果显示，相较于正常对照组，结肠炎小鼠结肠组织 SP 的 mRNA 和蛋白表达显著升高；免疫组化结果表明 SP 主要分布在肠道上皮与肌层。SP 与神经元标志物 MAP-2 双荧光染色证实，肠肌间神经丛、黏膜下神经丛内 SP 阳性神经元数量明显增加；神经元活化标志物 C-FOS 与 SP 共定位实验进一步证明，DSS 刺激可显著激活 SP 阳性神经元。该结果说明肠道发生炎症时，机体会上调内源性 SP 表达并激活 SP 阳性神经元，提示 SP 与结肠炎病理进程密切相关。
（二）外源性 SP 改善结肠炎整体病理表型
实验将小鼠分为空白组、DSS 模型组、DSS+SP 给药组、单纯 SP 组，连续 6 天尾静脉注射 SP 进行干预。动物表型结果显示，SP 可明显改善结肠炎小鼠体重下降、腹泻、便血等症状，显著降低疾病活动指数（DAI）；DSS 造成的结肠缩短、脾脏肿大等脏器病理改变也得到有效恢复。结肠组织 HE 染色及组织学评分表明，SP 能够减轻肠道炎性细胞浸润、隐窝损伤与上皮破坏。单纯 SP 处理组小鼠无明显病理损伤，证明该实验剂量下 SP 生物安全性良好，外源性 SP 可有效逆转 DSS 诱导的结肠炎病理表型。
（三）SP 修复结肠炎受损肠道屏障
肠道屏障损伤是结肠炎的核心病理特征，本研究从黏液屏障、紧密连接、上皮细胞稳态三个维度进行验证。（1）AB-PAS 染色：SP 可恢复结肠炎小鼠肠道杯状细胞数量，提升黏液分泌能力，修复肠道黏液屏障；
（2）透射电镜与分子检测：DSS 会造成肠道上皮细胞间隙增大、微绒毛断裂、紧密连接结构破损，SP 可修复上述超微结构损伤；qRT-PCR 与免疫组化结果显示，SP 显著上调紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin 的表达；
（3）上皮细胞增殖与凋亡：增殖标志物 PCNA 染色证明 SP 促进肠道上皮细胞增殖；蛋白免疫印迹结果显示 SP 上调抗凋亡蛋白 BCL-2、下调促凋亡蛋白 BAX，维持上皮细胞动态平衡。
以上结果证实 SP 可全方位修复受损的肠道物理屏障。
（四）SP 抑制肠道炎症反应、调控巨噬细胞极化与炎性因子
（1）巨噬细胞表型：CD68（总巨噬细胞）、CD206（M2 型抗炎巨噬细胞）双荧光染色显示，DSS 诱导巨噬细胞大量浸润且 M2 极化受阻，SP 可减少巨噬细胞浸润，并促进巨噬细胞向抗炎 M2 型极化；
（2）炎性因子谱检测：利用多因子芯片检测结肠组织与血清中 23 种细胞因子，DSS 模型组促炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17A、IFN-γ 等）大幅升高，抗炎因子（IL-4、IL-10）表达下调，SP 可逆转炎性因子失衡状态；
（3）体外细胞验证：以 TNF-α 刺激 Caco-2 细胞构建体外炎症模型，CCK-8 证实实验浓度 SP 无细胞毒性，AO/EB 染色显示 SP 减少炎症诱导的细胞凋亡，qRT-PCR 证明 SP 可剂量依赖性抑制促炎因子表达。体内外实验共同证实 SP 具备显著的抗炎作用。
用 Luminex 液相芯片技术，检测小鼠结肠组织、血清两类样本，种细胞因子;样本分为对照组、DSS 造模组、DSS+SP 干预组、SP 单独组，以此验证 SP 可调控细胞因子表达、发挥抗炎作用。
Luminex检测实验数据图
（五）SP 抑制 cGAS-STING 信号通路活化
cGAS-STING 是介导天然免疫炎症的关键通路。体内实验表明，DSS 可显著激活结肠组织中 cGAS、STING 蛋白，促进下游 TBK1、IRF3 磷酸化，同时上调 IFNβ、CXCL10、CCL5 等下游炎性介质；SP 可剂量依赖性抑制 cGAS-STING 通路全部关键分子的表达与活化。STING 与肠道上皮标志物 E-cadherin 共定位、STING 免疫组化结果直观证明 SP 降低肠道上皮细胞内 STING 异常表达。体外 TNF-α 诱导的 Caco-2 细胞模型中，SP 同样可抑制 cGAS-STING 通路活化，进一步明确 SP 的抗炎作用与抑制 cGAS-STING 通路直接相关。
（六）SP 保护线粒体、抑制 mtDNA 渗漏
线粒体损伤、mtDNA 胞质渗漏是激活 cGAS-STING 通路的重要上游信号。（1）氧化应激指标：DSS 导致结肠组织抗氧化酶 GSH-Px、总抗氧化能力（T-AOC）下降，脂质过氧化产物 MDA 蓄积，SP 可改善组织氧化应激水平；
（2）线粒体形态：透射电镜观察发现 DSS 诱导线粒体肿胀、嵴断裂、膜结构破损，SP 可修复线粒体形态损伤；
（3）mtDNA 定量：qPCR 检测证实 DSS/TNF-α 会促使 mtDNA（ND1、ND2、CytB、COXII）渗漏至血清与细胞上清，SP 可显著减少 mtDNA 释放；相关性分析证明血清 mtDNA 水平与促炎因子含量呈正相关；
（4）线粒体功能：JC-1 染色显示 SP 缓解 TNF-α 诱导的线粒体膜电位崩解，同时下调促线粒体通透性转换的 BAX 蛋白。
该部分证实 SP 通过保护线粒体功能、阻断 mtDNA 渗漏，间接抑制 cGAS-STING 通路。
（七）mtDNA 介导 SP 对 cGAS-STING 通路的调控作用
通过mtDNA 转染和mtDNA 耗竭实验明确 mtDNA 的中介作用。向外源转染 mtDNA 的 Caco-2 细胞中，cGAS-STING 通路被显著激活，同时 SP 对该通路的抑制效应被逆转；利用溴化乙锭（EtBr）耗竭细胞内 mtDNA 后，TNF-α 诱导的 cGAS-STING 活化显著减弱。此外，在 mtDNA 完全耗竭的细胞中，SP 依旧可抑制 STING 及下游信号，说明 SP 除阻断 mtDNA 渗漏外，还存在直接调控 STING 的作用方式。
（八）SP 通过 NK1R 直接靶向抑制 STING 通路
（1）蛋白互作与定位：蛋白分子对接结果显示 SP 受体 NK1R 与 STING 存在强结合能力，细胞免疫荧光验证二者在 Caco-2 细胞内共定位；
（2）STING 激动剂干预：分别使用 STING 特异性激动剂 DMXAA、SR717 处理细胞，两种激动剂均可激活 STING-TBK1-IRF3 信号轴，而 SP 能够有效逆转激动剂引发的通路活化。
该结果证明 SP 可借助 NK1R 直接结合并抑制 STING，形成不依赖 mtDNA 的独立调控通路。
（九）SP 通过抑制 cGAS-STING 通路缓解肠道上皮细胞铁死亡
铁死亡是结肠炎上皮损伤的重要程序性细胞死亡方式。体内实验显示，DSS 会上调铁死亡促进因子 COX-2、PTGS2、ACSL4，下调抑铁死亡蛋白 GPX4、FTH1，SP 可逆转上述标志物的异常表达。体外实验中，mtDNA 转染、STING 激动剂 SR717 处理均会加剧 TNF-α 诱导的细胞铁死亡，并抵消 SP 的保护作用。结果证实，SP 抑制铁死亡的功能完全依赖于对 cGAS-STING 通路的阻断。
（十）SP 的生物学功能依赖 NK1R 受体
NK1R 是 SP 的高亲和力特异性受体。实验发现 DSS 下调结肠组织 NK1R 表达，SP 干预可显著回升 NK1R 水平；NK1R 与 cGAS、E-cadherin 共定位实验证明 NK1R 在肠道上皮中与 cGAS-STING 通路分子空间关联。使用 NK1R 特异性拮抗剂 L-732138 预处理细胞后，SP 对 cGAS-STING 通路、炎性因子、铁死亡的抑制效应全部被逆转。该实验完整证实，SP 发挥抗炎、抑铁死亡、调控通路等所有功能均以 NK1R 为必需受体。
（十一）整体作用机制模型
结肠炎病理状态下，线粒体受损引发 mtDNA 渗漏，激活 cGAS-STING 通路，同步诱发炎症反应与上皮细胞铁死亡，加重肠道损伤。外源性 SP 结合细胞膜 NK1R 后，一方面保护线粒体、阻止 mtDNA 释放，间接抑制 cGAS-STING 通路；另一方面通过 NK1R 与 STING 直接互作，阻断 STING 活化。双重作用下 cGAS-STING 通路被抑制，炎症与铁死亡进程同时减弱，最终修复肠道屏障、缓解结肠炎。