【技术应用】邻近连接技术PLA应用实例介绍—第Ⅱ期：蛋白-RNA
RNA在细胞内绝不是孤立存在的，它们一出生（转录）就会被各种RNA结合蛋白（RBP）包裹，形成核糖核酸蛋白复合物（RNP）。从RNA的剪接、转运、定位、稳定性到最终的翻译和降解，每一个环节都由特定的蛋白质精密操控。因此，蛋白-RNA相互作用（RPI）是细胞生命活动的核心控制纽带之一。许多人类疾病（如渐冻症ALS、阿尔茨海默病等神经退行性疾病，以及多种癌症）的本质就是RNA-RBP复合物的异常聚集或功能失调。然而。传统的研究RPI的方法有基于抗体富集的CLIP-seq/RIP和基于核酸探针捕获的 CHIRP-MS/RAP-MS。但是传统的研究RPI的方法需要先裂解细胞。细胞一旦破裂，原本物理隔离的蛋白和RNA就会产生错误结合，产生极高的假阳性。同时，一些结合不紧密的蛋白质也会在洗涤过程中丢失。而且，传统CLIP需要紫外线（UV）促成共价键。但UV的交叉联结效率通常极低（往往小于1%），且对某些不含芳香族氨基酸的接触面基本无效。
近年来，邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）的引入，彻底改变了我们对活细胞内“RNA-蛋白质”这一动态世界的认知。邻近标记技术的引入实现了“原位快照”。它通过在靶点（特定蛋白或特定RNA）上融合一个“原位标记酶”（如APEX2、TurboID），在活细胞状态下，往周围数纳米（nm）半径内的所有分子上共价修饰上生物素。然后研究者可以正常裂解细胞，用链霉亲和素强力富集被标记的分子。它的本质是把“体内不稳定的互作”转变成了“体外极度稳定的共价结合”进行纯化。
PART 01亚细胞空间分辨率的RIP
RBPs 约占人类蛋白质组的 10%，它们通过与 RNA 发生非共价相互作用，在转录、翻译、染色质组织和细胞应激响应中发挥核心调控作用 。传统研究 RNA-binding proteins（RBPs）的方法，如：免疫共沉淀、亚细胞分离、 OOPS（有机相分离）、 oligo(dT)捕获，虽然能找到RBPs，但无法精确知道“蛋白在什么时候、什么位置与RNA结合”会丢失空间（细胞内定位）和时间（动态变化）信息。细胞器离心沉淀虽能提供空间定位，但无法应用于没有膜包裹的细胞微区（如核仁、应激颗粒、线粒体外膜区），因为这些结构在细胞裂解离心时就会解体或混杂 。而且许多 RBP 与 RNA 的结合是弱相互作用（Weak）或瞬时相互作用（Transient），在体外纯化和洗涤过程中极易丢失 。
PLA技术并不是单独使用的，而是作为“空间定位引擎”来使用，作者将邻近标记技术（PLA）与有机-水相分离技术进行串联（APEX-PS）。首先，作者将APEX2邻近标记定位到细胞核，成功富集到hnRNPC、SRSF1等经典核RNA结合蛋白，同时排除了线粒体蛋白和非RBP蛋白，这说明：PLA技术具备很高空间特异性。利用该技术，研究人员成功绘制了人类细胞中细胞核、核仁（无膜）以及线粒体外膜（OMM）三个特定亚细胞微区的“空间RNA结合蛋白图谱（RBPomes）。作者通过对线粒体外膜（OMM）图谱的研究，发现了一个定位在线粒体外膜的 RBP-SYNJ2BP (图1)。当细胞面临翻译抑制、高温或氧化应激等压力时，细胞内的多聚核糖体（Polysomes）会解体。此时，SYNJ2BP 就像一个“安全锚”，在应激状态下选择性地将一系列核基因编码的线粒体 mRNA 牢牢扣留、锚定在线粒体外膜表面，保护它们不被降解或错误分流。当细胞从应激中准备恢复时，被 SYNJ2BP 守护的这些 mRNA 能够就地恢复局部翻译，使产生的蛋白质能立即就近导入线粒体。
图1：通过 APEX-PS 技术对位于线粒体外膜上的 RNA 聚集蛋白进行蛋白质组学分析 （Qinet al., 2021）
PART 02无膜细胞器-应激颗粒的转录组特征
在细胞内，mRNA绝不是随机散落的。它们会与各种RNA结合蛋白（RBP）组装成极其动态的复合物，并被精确运送到细胞的特定区域进行翻译、暂存或降解。当细胞受到外界刺激（如高温、药物）时，细胞会主动暂停非必要的蛋白质翻译，将这些未翻译的mRNA与特定的蛋白质聚集在一起，通过液-液相分离（LLPS）形成没有膜包裹的凝聚体，称为“应激颗粒”。传统上要研究一个无膜细胞器或特定蛋白质复合物里“包含了哪些RNA”，通常依赖体外物理分离（如连续离心）或抗体富集（如RIP-seq）。但是，应激颗粒等结构高度动态且极其不稳定，在细胞裂解和离心洗涤的过程中极易解体或发生非特异性混杂，导致科学家无法在活细胞最真实的状态下，精准测定哪些RNA真正定位在这些结构中。传统RNA研究方法（如CLIP、FISH等）存在局限：CLIP只能检测“直接结合”、FISH分辨率有限难以研究动态、弱相互作用、无法很好解析无膜细胞器（如Stress Granule）。作者开发了一种名为 APEX-Seq 的“一种基于APEX2邻近标记的RNA空间组学技术”的高通量测序技术平台，并利用该技术首次绘制了活细胞内翻译起始复合物及不同应激颗粒的RNA空间全景图谱 (图2)。
研究人员将工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）融合到特定的标志性RNA结合蛋白上。在活细胞状态下，通过加入生物素-苯酚（Biotin-phenoyl）和极低浓度的过氧化氢反应 1分钟。APEX2 会将周围纳米级半径范围内的 RNA 催化标记上生物素，随后裂解细胞，用链霉亲和素磁珠富集并进行高通量测序。分析表明，通过对比融合在 eIF4E（靠近 mRNA 5'帽端）、eIF4A1（解旋酶）和 eIF3/PABP 上的 APEX2 标记结果，成功区分了哪些 mRNA 的 5' UTR 区段更紧密地包裹在复合物的核心内部，哪些区段则暴露在外。过去人们普遍认为，不论受什么刺激，细胞形成的应激颗粒成分都大同小异。但 APEX-Seq 的对比发现不同压力源（Stressor）导致的应激颗粒，其内部的 RNA 组成具有显著差异，热休克（Heat Shock）激发的应激颗粒：强烈且选择性地富集了长度更长、且其翻译效率在正常状态下就比较低的特定 mRNA 转录本，药物（Hippuristanol，翻译抑制剂）激发的应激颗粒：招募的 mRNA 范围则更广、更随机，其 RNA 的富集与转录本长度或初始翻译效率关联度不高 (图3)。
图2：RNA 的 APEX邻近生物素标记法 (Padrónet al., 2019）
图3：不同应激源下，应力颗粒中的 RNA 组成存在差异 (Padrónet al., 2019）
邻近标记技术因其能够在活细胞内记录空间邻近分子而被广泛应用于蛋白–RNA互作研究，尤其适用于传统方法难以捕获的动态互作场景。例如，对于亲和力较低的弱相互作用，传统免疫共沉淀或洗脱过程中往往容易发生复合物丢失，而邻近标记能够在细胞内直接“固定”这些邻近关系；对于酶促反应、信号转导或核质转运过程中出现的瞬时相互作用，邻近标记也能够凭借快速标记能力实现动态捕获。此外，许多蛋白–RNA互作只发生在特定亚细胞微区，如线粒体表面、核仁或核孔附近，邻近标记技术能够结合亚细胞定位信息解析这些空间特异性互作。更重要的是，在应激颗粒（Stress Granule）、P-body以及神经元RNA颗粒等无膜细胞器研究中，由于这些结构高度动态、缺乏明确物理边界，传统离心或纯化方法难以有效分离，而邻近标记技术则为解析其内部蛋白组成和RNA互作网络提供了重要手段。
参考文献
Qin W, Myers SA, Carey DK, Carr SA, Ting AY. Spatiotemporally-resolved mapping of RNA binding proteins via functional proximity labeling reveals a mitochondrial mRNA anchor promoting stress recovery.Nat Commun. 2021 Aug 17;12(1):4980.
Padrón A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA Labeling by APEX-Seq Reveals the Organization of Translation Initiation Complexes and Repressive RNA Granules.Mol Cell. 2019 Aug 22;75(4):875-887.e5.