一、“酵母筛库”的定义在之前的介绍中我们向大家科普了“酵母文库构建”的概念那对于构建好的文库我们可以进行单双杂筛库去研究该基因的分子机制也就是酵母文库筛选实验它是一种在酵母细胞内寻找与目标基因相互作用的未知基因的经典方法。简单来说就是用你感兴趣的 “诱饵”去一个包含多种基因的 “文库鱼塘” 里钓鱼找出能和它结合的 “猎物”。二、常见的酵母筛库实验有哪些酵母筛库根据不同的实验目的可选择相应的实验类型例如研究蛋白-蛋白类互作蛋白-核酸类互作时所选的实验体系是不同的下面我们看下具体该如何选择。当研究目标为蛋白-蛋白类互作时我们可选择酵母双杂交筛选经典的酵母双杂交有核体系和膜体系核体系依赖细胞核内转录激活两者的互作发生在细胞核内进而接触核内的启动子激活报告基因核体系可筛选核蛋白、胞质可溶性蛋白。图酵母双杂交原理核体系而有些蛋白质定位于细胞膜或者膜系统上例如叶绿体膜、线粒体膜等各种细胞器膜因为膜蛋白往往有跨膜结构无法进入细胞核所以这种情况更适用于膜体系。在膜体系双杂交实验中诱饵蛋白因不同的定位、跨膜结构域数量、信号肽存在情况不同以及C/N端在细胞内的位置情况不同所以诱饵载体选择类型会很多那具体该如何选择这里我们也给大家列出来了见下表1当然如果我们不能通过亚细胞定位、信号肽有无等方式判断出载体类型我们可以通过“酵母膜蛋白功能验证实验”来确定载体见下表2该表展示的是膜体系酵母双杂交里的功能验证组实验设计用同一诱饵蛋白 A 构建三种不同融合方式的诱饵质粒再与阳性对照质粒 pOst1-NubI 共转通过观察哪一组能激活报告基因进而确定膜蛋白的载体类型。表1膜体系酵母双杂交载体选择类型表2酵母膜蛋白功能验证组别图酵母双杂交原理膜体系除了常规的酵母双杂交筛选实验外还有CrY2H-seq库与库筛选实验能够在同一体系内对两个大规模蛋白文库进行高通量的两两互作检测一次性完成数万到数百万种蛋白对的互作筛查构建大规模互作网络。它是一种将Cre‑loxP 位点特异性重组、经典酵母双杂交Y2H与高通量测序NGS整合的高通量蛋白质互作筛选技术其核心原理是在改造的酵母菌株 CRY8930 中同时整合 GAL1::HIS3、GAL2::ADE2 和 GAL7::CRE 三套报告系统启动子要表达的基因当蛋白BD‑X位于 pDBlox 质粒与蛋白AD‑Y位于 pADlox 质粒发生相互作用时会重构 GAL4 转录因子并同步激活 HIS3 营养缺陷筛选标记与 Cre 重组酶表达Cre 重组酶进而特异性识别并催化两个质粒上 3’端的突变型 lox66 与 lox71 位点发生单向、不可逆的分子重组将原本独立的 X 与 Y 蛋白编码序列连接成一段稳定的 BD‑ORF‑X‑lox77‑AD‑ORF‑Y 融合 DNA 片段该融合片段可通过特异性引物 PCR 扩增再经 Illumina 高通量测序与生物信息学分析从而批量明确Lox77蛋白互作对直接通过读段匹配确定互作蛋白对实现无需单独挑克隆大规模的 “库对库” 全互作组检测大幅提升了蛋白质互作筛选的通量、效率与可靠性。图CrY2H-seq库与库筛选原理当研究目标为蛋白-核酸类互作时则可选择酵母单杂交系统。通常集中于研究转录因子与启动子之间的互作探明目标基因的转录调控机制酵母单杂交以特定的 DNA 片段如启动子、顺式作用元件作为诱饵将待检测的转录因子以转录激活结构域AD融合的形式导入酵母细胞如果转录因子能够特异性结合该 DNA 序列就会招募转录激活复合体transcription activation machinery启动报告基因表达从而实现用已知 DNA 筛选或验证其结合的转录因子适用于鉴定调控某一启动子的关键转录因子、验证蛋白与 DNA 的特异性结合。图酵母单杂交原理反向酵母单杂交酵母TF Centered Y1H筛选则反过来以转录因子作为诱饵同时将启动子或者是motif文库——转录因子一般与基因5’端上游特定序列专一性结合即保守短序列片段一般由7个碱基随机组成文库作为猎物构建到报告基因上游如果转录因子能够识别并结合对应的motif序列就会激活报告基因表达从而实现用已知蛋白筛选其结合靶标启动子适用于鉴定转录因子的结合元件、绘制 DNA 结合位点等。图酵母TF Centered Y1H原理那介绍到这里大家是不是对不同的筛库实验有了一定的了解呢下面我们一起来了解下部分实验的交付情况。三、技术优势1.高质量检测✅ 严格自激活质控3-AT抑制或截短实验验证排除假阳性干扰。✅ 三缺、四缺结合x-α-gal/x-gal等多维度背景平板检测提高阳性筛选率。案例展示——自激活实验筛选实验开始前诱饵基因严格进行自激活检测实验组别包含完整的阳性与阴性对照检测平板在三四缺平板基础上加以x-α-gal试剂检测实验结果更可靠。2.高标准交付✅ 提供一代、二代测序以及联合分析结果筛库结果准确度更高候选互作阳性克隆序列至少交付15条以上。✅ 二代测序提供GOKEGG分析明确互作基因的功能分类与信号通路类型。案例展示——以酵母双杂交为例三缺平板初筛、四缺平板精筛后挑取近100左右的克隆做一代测序Blast分析比对去重后再次进行四缺平板复筛多次筛选保障互作效果真实准确性二代测序则包含GO与KEGG分析结果可为筛选候选互作蛋白提供参考依据同时提供一代二代阳性克隆测序数据可进行联合分析可以快速锁定最具互作潜力的目标蛋白。图阳性克隆复筛结果图一代测序、二代测序结果GO分析结果KEGG分析结果3.创新研发体系✅ 推出“保证型” 筛库套餐阳性结果兜底承诺承诺交付至少一对全长基因阳性互作验证结果。流程展示——保证型酵母核文库双杂交筛选四、文献应用1.酵母核文库双杂交筛选2025年12月法国Charlotte Delesalle团队在期刊Plant Communications发表“Arabidopsis microtubule-BRI1-associated proteins negatively regulate hypocotyl elongation by controlling brassinosteroid-dependent cortical microtubule reorientation”一文IF11.76。油菜素甾醇BRs是一类类固醇植物激素对植物的生长发育及环境胁迫适应至关重要。本研究鉴定并解析了一个全新的BRI1 互作蛋白家族将其命名为微管BRI1 关联蛋白MBAPs。研究通过酵母双杂交筛选鉴定出 MBAP1、MBAP2、MBAP3 三个新的互作蛋白一对一互作验证证实 BRI1 与 MBAP1/2/3 均存在直接特异性相互作用且无自激活现象图左。进一步通过该实验将MBAP1进行截短确定 MBAP1 中 19 个氨基酸的保守区域为介导二者结合的必要且充分区段证实 MBAPs 是植物细胞中 BRI1 的真实互作伴侣图右该结果为阐明油菜素甾醇信号如何调控微管重排提供了关键证据。2.酵母核文库单杂交筛选2026年3月西北农林科技大学园艺学院龚春梅教授团队在期刊New Phytologist上发表“CsTCP14b enhances drought tolerance in tea plants during early-stage drought stress by promoting flavonol-mediated ROS scavenging”一文IF8.5。本文通过将转录组测序RNA‑seq分析与CsTCP14b的功能验证及调控网络解析相结合证实该转录因子能够促进黄酮醇的生物合成进而增强活性氧ROS清除能力赋予茶树早期干旱胁迫耐受性。CsTCP14b 在干旱胁迫早期被快速诱导研究通过酵母单杂交实验图f、h证实CsTCP14b 和 CsREV可直接结合 CsFLSb 的启动子区域并激活其转录检测黄酮醇含量发现其积累增加茶树ROS 清除能力明显增强氧化损伤减轻耐旱性得到提升。3.酵母TF Centered Y1H筛选署名文章*2025年9月浙江省农业科学院洪高洁研究团队在Plant Biotechnology Journal期刊上发表“OsSTK-Mediated Sakuranetin Biosynthesis and Carbon Flux Orchestrate Growth and Defence in Rice”一文IF10.5。OsSTK是水稻中注释的丝氨酸/苏氨酸激酶基因其同源基因在拟南芥、小麦等作物中被报道参与胁迫信号传导。本篇文章围绕OsSTK是否是水稻生长-防御平衡的关键调控因子其分子机制是否涉及樱花素生物合成与碳流重分配等关键问题展开研究。研究通过反向单杂筛库图E确定了OsSTK能够结合的OsNOMT 的motif序列通过双荧光素酶报告基因实验以及酵母单杂实验证明OsSTK与OsNOMT启动子具体结合的区域即ATG上游1000~2000bp图B。这些研究结果为发现蔗糖处理和稻瘟感染可诱导OsSTK的表达OsSTK 会与OsNOMT 的启动子结合并激活其表达从而导致樱花素积累增强水稻对稻瘟病的抗性的结论提供理论基础。本文反向单杂筛选的motif文库由南京瑞源生物提供*。
