摘要MSC-EV相关研究和转化应用持续推进但上游生产的规模化放大仍然是工艺开发中的重要问题。本研究基于无动物源MSC及配套培养基体系采用微载体-搅拌罐生物反应器工艺在250 mL规模完成关键工艺参数优化后将工艺进一步放大至15 L。结果显示放大后的EV颗粒产量、粒径分布、经典EV标志物以及体外生物功能与250 mL体系具有较好的可比性为MSC-EV从小规模工艺开发向更大体积制造体系转移提供了参考。关键词外泌体、细胞外囊泡、MSC-EV、规模化生产、搅拌罐生物反应器、微载体、关键工艺参数、CPP、关键质量属性、CQA、RoosterBio2023 ISEV年会上RoosterBio与Sartorius Stedim North America联合发布学术海报《Successful development of a scalable and robust process for MSC-EV production》介绍了一套基于微载体-搅拌罐生物反应器的hMSC-EV生产工艺。研究首先在250 mL规模评估和优化关键工艺参数CPP随后将确定的工艺条件放大至15 L Biostat STR进行验证并进一步比较两个规模之间的细胞扩增、EV颗粒产量、粒径、标志物和生物功能等关键质量属性CQA。细胞外囊泡Extracellular VesiclesEVs是多种类型细胞释放的纳米级脂质双层颗粒内部可携带蛋白质、RNA、DNA以及脂质等生物货物。随着MSC来源EV相关研究不断发展上游生产需要面对一个越来越现实的问题如何从实验室规模逐步扩大到更高产量体系同时避免MSC状态、EV产量和质量属性随着规模发生明显漂移。这项研究正是围绕这一工艺放大问题展开。RoosterBio MSC和EV相关培养体系资料可参考RoosterBio MSC与MSC-EV技术资料。一、背景MSC-EV规模化生产需要同时解决细胞、产量和质量问题EV生产从小规模走向更大规模时不能仅依靠增加二维培养面积解决因为MSC本身属于贴壁依赖细胞培养面积扩大意味着更多培养容器、培养基、人工操作和批次差异。微载体-搅拌罐体系通过在反应器内部提供大量细胞附着表面积使MSC能够在动态环境中扩增为规模化上游生产提供另一种实现路径。与此同时MSC-EV工艺的目标并不只是获得更多颗粒。大规模体系还必须保持与小规模相似的MSC生长表现并确认最终EV颗粒的数量、粒径、膜结构、标志物和功能没有发生明显变化。因此这项研究先利用小规模体系建立CPP再通过15 L放大验证CQA是否保持可比。二、研究设计250mL小试开发与15L放大验证2.1 主要物料MSC、扩增培养基和EV收集培养基本研究以无动物源人骨髓MSC Rooster Vial-hBM作为生产细胞来源使用Rooster Nourish培养基在Ambr 250系统中进行MSC扩增。进入EV分泌和收集阶段后培养体系切换至低颗粒EV收集培养基Rooster Collect-EV。整个流程采用微载体和搅拌罐生物反应器体系完成从而将MSC扩增和EV收集连接为一个连续上游生产流程。2.2 开发与验证策略先优化CPP再比较放大后的CQA研究采用“小规模开发、大规模验证”的两步策略。在250 mL系统中主要评估微载体类型、MSC扩增时长、微载体密度、初始细胞接种密度以及EV收集时间等关键工艺参数。完成小规模筛选之后再将确定的CPP转移到15 L生物反应器中进行验证。与此同时研究还评价了多个关键质量属性包括颗粒数量和粒径、经典EV标志物、脂质膜颗粒比例以及生物效价从而判断放大之后得到的EV条件培养液是否与小规模体系保持较好的可比性。图1RoosterBio MSC-EV生产工艺流程图。三、250mL工艺开发确定微载体、细胞密度和培养时间窗口在250 mL系统中研究团队对多个CPP进行了系统评价。微载体筛选结果显示Synthemax II微载体可获得约80%的MSC贴壁率因此进入后续实验MSC生长在培养第5天达到峰值后趋于稳定因此将5天确定为MSC生长阶段时长微载体密度设置为3X能够提高细胞产量1X细胞接种密度已经可以获得较高细胞产量同时不会引起明显的细胞/微载体聚集进入EV收集阶段并切换至Rooster Collect-EV之后颗粒产量持续提高并在收集阶段第5天达到峰值因此EV收集时间同样确定为5天。采用以上优化参数之后250 mL体系在收获日可稳定获得可比的细胞数量以及约1–1.5×10¹⁰ particles/mL的EV颗粒产量同时两个不同供者以及3个独立批次之间均表现出较好的重复性。图2小规模工艺开发结果——供者间和批次间一致性。参数优化结果微载体类型Synthemax IICorning微载体密度3X细胞接种密度1XMSC生长时长5天EV收集培养基Rooster Collect-EVEV收集时长5天表1250mL开发优化的部分关键工艺参数四、15L放大验证细胞密度和EV颗粒产量保持可比15 L生物反应器中的整体工艺包括种子扩增4天、MSC生长阶段5天和EV收集阶段5天并继续使用1X细胞接种密度和3X微载体密度。在MSC生长阶段结束之后培养体系更换为EV收集培养基并进入颗粒收集。放大结果显示15 L体系中的MSC在生长阶段第5天达到约4E5 cells/mL与250 mL体系结果相当EV收集阶段第5天颗粒产量达到约1.7×10¹⁰ particles/mL同样与小规模阶段获得的1–1.5×10¹⁰ particles/mL具有较好的可比性。细胞生长和颗粒收集两个维度均没有因规模从250 mL扩大到15 L而出现明显下降。图315L放大验证——细胞生长与颗粒收集结果。五、CQA评价从颗粒数量进一步观察身份、粒径和功能研究没有仅用颗粒数量判断工艺是否放大成功而是使用多种方法对收获物进行表征。NTA和荧光膜染色结果显示在检测到的纳米颗粒中约91%的颗粒对MemGlow脂质膜染料呈阳性提示大部分颗粒具有脂质膜结构特征。图4颗粒完整性分析。不同生产规模和不同收集时长条件下颗粒粒径分布保持一致说明250 mL和15 L体系之间没有出现明显的粒径群体漂移。图5EV粒径分布。在EV相关蛋白检测方面收获的条件培养基中检出了四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81同时检测到TSG101两个生产规模之间的表现差异不大。研究还通过多种独立分析方法对颗粒进行交叉确认为脂质双分子层囊泡特征提供进一步证据。功能评价方面研究使用HUVEC划痕愈合实验测试15 L Biostat STR收获的EV条件培养基。结果显示该条件培养基对应的伤口闭合表现优于未条件化培养基阴性对照并与生长培养基阳性对照相当。图6HUVEC划痕愈合效力。六、研究结论MSC-EV放大需要同时证明工艺和质量可比本研究建立了一套微载体-搅拌罐hMSC-EV生产流程以Rooster Vial-hBM无动物源人骨髓MSC为生产细胞配合Rooster Nourish MSC扩增培养基和Rooster Collect-EV低颗粒收集培养基在250 mL规模完成工艺开发再进一步将工艺扩大至15 L Biostat STR。从研究结果来看250 mL和15 L体系在MSC细胞生长、单位体积EV颗粒产量、粒径分布、经典EV标志物以及体外划痕愈合功能等方面保持了较好的可比性。这说明通过先建立小规模CPP再利用CQA验证大规模体系的方式可以为MSC-EV上游生产的工程化放大提供较清晰的开发路径。对于实际MSC-EV药物或工艺研发而言这项研究更值得借鉴的是“高质量起始细胞匹配的MSC扩增/EV收集培养体系微载体搅拌罐CPP/CQA评价”的整体思路而不是直接复制某一个具体参数。不同细胞来源、设备和培养体系仍需要重新建立自身工艺窗口。产品名称在本工艺中的作用Rooster Vial-hBM无动物源人骨髓MSCxeno-free hBM MSC作为EV生产细胞来源Rooster NourishMSC扩增培养基用于250mL及15L间充质干细胞扩增Rooster Collect-EV低颗粒EV收集培养基用于EV收集阶段表2本研究使用的RoosterBio产品关于RoosterBio相关MSC-EV培养体系RoosterBio的MSC和EV相关体系覆盖MSC细胞来源、扩增以及EV收集等上游培养环节。本研究中实际使用的是Rooster Vial-hBM、Rooster Nourish和Rooster Collect-EV三类产品分别对应生产细胞来源、MSC扩增阶段和EV收集阶段。对于正在建立微载体或搅拌罐MSC-EV工艺的研究团队可将细胞来源、扩增培养环境和收集阶段作为一个连续体系进行评价而不是将各环节完全割裂。推荐阅读RoosterBio MSC与MSC-EV培养技术资料Rooster化学成分限定低背景EV收集培养相关资料MSC扩增与EV收集培养基组合相关资料Rooster HD-EV扩增收集一体化培养基资料Agent V-DSP外泌体下游纯化相关资料关于技术来源本文基于RoosterBio与Sartorius公开的2023 ISEV MSC-EV规模化生产海报及相关技术资料曼博生物整理仅用于科研信息分享和实验工艺参考。本文涉及的Synthemax II微载体、3X微载体密度、1X细胞接种密度、5天MSC扩增、5天EV收集、1–1.5×10¹⁰ particles/mL以及15 L约1.7×10¹⁰ particles/mL等数据均来源于该研究的特定实验体系实际应用时应结合MSC来源、生物反应器、培养基、搅拌条件、EV纯化方法和分析体系进行重新验证。本文围绕RoosterBio、Rooster Vial-hBM、Rooster Nourish、Rooster Collect-EV、MSC-EV、微载体生物反应器、CPP、CQA、EV质量表征和规模化生产等方向整理相关公开技术信息。