一、文章介绍空间转录组学Spatial Transcriptomics, ST技术已成为评估组织切片中基因表达的有力工具为理解健康和疾病中的组织多样性、细胞组成和潜在机制提供了关键见解。然而ST数据分析与可视化面临若干瓶颈低采样量和组织形态学差异限制了统计功效并阻碍了不同实验组间的可靠比较同时需要可解释、全面且空间感知的基因表达模式和通路可视化方法来探究异质组织内的复杂生物学过程。为克服这些局限Dimitri Sokolowski、Alexander J. Trostle及其合作者在Bioinformatics上发表了题为“SpatialFlux: an R package for distance gradient analysis in spatial transcriptomics”的应用笔记介绍了一个名为SpatialFlux的R包旨在进行基于参考点的距离梯度分析。SpatialFlux的核心方法建立在研究团队先前提出的参考点距离梯度分析策略之上。该策略通过选择一组空间点作为“参考点”计算所有其他目标点相对于这些参考点的欧几里得距离从而沿距离轴以梯度方式评估基因表达。距离梯度分析通过沿距离轴平均基因表达来最小化样本间组织架构差异有助于获得可推广的基因和通路表达梯度合并形态不同的多个样本以增加样本量、降低噪声、提高统计功效。SpatialFlux的输入为标准Seurat对象适用于10x Visium/VisiumHD数据利用二维平面坐标(x,y)(x,y)(x,y)表示空间点的位置。参考点的选择有三种灵活策略1通过包内置的交互式Shiny应用程序选择单个或多个空间点2基于聚类身份选择空间点3使用影像分析软件如Fiji/ImageJ手动绘制参考线通过坐标文件导入。所有参考点与所有目标点之间的欧几里得距离通过d(x,y)(xi−yi)2(xj−yj)2d(x,y) \sqrt{(x_i - y_i)^2 (x_j - y_j)^2}d(x,y)(xi​−yi​)2(xj​−yj​)2​计算其中xxx和yyy分别为参考点和目标点坐标。每个目标点到最近参考点的最小距离称为“spatialvalues”存储在Seurat对象元数据中用于初步梯度距离评估。SpatialFlux提供两种分析模式无偏发现模式和有偏定向模式。在无偏模式下将spatialvalues代入Monocle3格式对象利用其内置差异表达函数识别与距离相关的基因再通过层次聚类识别沿距离轴具有不同峰值表达位置的基因簇并进行GO富集分析。在有偏模式下用户可指定特定基因或通路模块分数沿距离轴可视化其表达变化实现定向假设检验。研究者使用小鼠胫骨骨折的公开10x Visium数据集GEO: GSE218046展示SpatialFlux的应用。通过手动选择骨折处的空间点作为参考计算所有点至骨折线的距离生成距离梯度可视化。差异表达分析结合层次聚类识别出5个在距离骨折线不同位置具有峰值表达的基因簇。近骨折线处上调基因富集于基质组织相关GO术语中距离处与细胞外基质和炎症相关远距离处与代谢过程相关。有偏分析显示从近到远软骨相关基因Acan、Col2a1迅速下降而成骨基因Bglap上调与WNT和BMP信号通路活性一致精确复现了已知的软骨内成骨过程。在肝脏分区验证中以Cyp2e1经典门静脉周围标志物为参考SpatialFlux完全复现了从中心静脉区到门静脉区的核心信号梯度证明其在高复杂组织架构中评估精细空间受限基因表达的能力。二、算法原理介绍SpatialFlux的算法原理围绕“参考点选择 → 欧几里得距离映射 → 无偏/有偏表达分析”三个核心步骤展开。一参考点选择与距离计算。用户可通过三种方式定义参考点1Shiny应用中点击选择空间点2基于Seurat聚类标签批量选择3从Fiji/ImageJ绘制的参考线提取坐标点。参考点集合R{r1,r2,...,rm}R \{r_1, r_2, ..., r_m\}R{r1​,r2​,...,rm​}目标点集合T{t1,t2,...,tn}T \{t_1, t_2, ..., t_n\}T{t1​,t2​,...,tn​}ri(xi,yi)r_i (x_i, y_i)ri​(xi​,yi​)tj(xj,yj)t_j (x_j, y_j)tj​(xj​,yj​)。对每个目标点tjt_jtj​计算其到所有参考点的欧几里得距离dij(xi−xj)2(yi−yj)2d_{ij} \sqrt{(x_i - x_j)^2 (y_i - y_j)^2}dij​(xi​−xj​)2(yi​−yj​)2​取最小值作为该点的“spatialvalues”sjmin⁡idijs_j \min_i d_{ij}sj​mini​dij​。这些值被添加到Seurat对象元数据中作为距离梯度的定量表示。对于多张切片距离值被归一化到同一轴使不同形态的切片可合并分析。二无偏模式Monocle3驱动的差异表达与聚类。将Seurat对象转换为Monocle3的cell_data_set对象以spatialvalues作为“伪时间”排序维度。使用Monocle3的graph_test()函数基于负二项模型检测与距离显著相关的基因q值0.05。对显著基因进行层次聚类基于表达模式的Spearman距离 Ward链接识别沿距离轴具有不同峰值表达位置的基因簇默认5簇用户可调。每个簇的基因可导出用于GO/通路富集分析支持clusterProfiler等工具。三有偏模式基因和通路模块的定向可视化。用户指定感兴趣的基因列表或通路基因集SpatialFlux计算沿距离轴的每个bin用户定义距离区间的平均表达或模块分数使用Seurat的AddModuleScore或AverageExpression。输出包括1散点图显示基因表达随距离的变化趋势可选拟合平滑曲线2热图显示多个基因/通路沿距离轴的动态变化3如果有多张切片可叠加显示均值±标准差评估跨样本一致性。这种“对齐到同一距离轴”的策略使形态不同的切片可在相同尺度上比较有效增加样本量并降低噪声。三、总结SpatialFlux是一个用于空间转录组学距离梯度分析的R包通过选择参考点计算所有空间点到参考点的欧几里得距离将组织形态差异“对齐”到统一的距离轴上从而支持无偏发现Monocle3差异表达聚类GO富集和有偏定向指定基因/通路沿梯度可视化两种分析模式。其核心创新在于以距离梯度代替原始空间坐标作为分析维度使形态不同的组织切片可合并分析以增加统计功效同时保留空间信息的生物学解读。SpatialFlux在小鼠骨折模型中精确复现了从软骨到成骨的时空转变梯度在肝脏分区中完整重现了中心静脉-门静脉信号梯度为空间转录组学中跨切片、跨形态的基因表达比较提供了灵活易用的计算工具。