被称为“小麦癌症”的赤霉病Fusarium Head Blight, FHB不仅造成严重减产产生的呕吐毒素DON更直接威胁粮食与食品安全。然而小麦自身如何快速启动基础免疫、又如何避免免疫过度激活带来生长代价一直是植物免疫领域的未解之谜。近日浙江大学农业与生物技术学院马忠华团队与刘尊勇团队合作在Nature Plants发表题为“Epigenetic regulation of TaFIP phytocytokine clusters confers basal resistance via receptor kinase TaFIPR in wheat”的论文首次揭示小麦通过H3K4me3/H3K27me3双价修饰精准调控植物小肽簇TaFIPs使其具备对病原菌的“快速响应”能力。研究进一步发现LRR受体激酶TaFIPR识别TaFIPs后激活免疫通路显著提升小麦对赤霉病和茎基腐病的抗性。爱基百客为本研究提供了CUTTag技术支持。研究内容01 小麦中Fusarium诱导的TaFIP细胞因子簇鉴定为了鉴定参与小麦镰刀菌抗性的潜在小肽研究分析了Fg感染下的小麦转录组数据鉴定出一个由13个成员组成的小肽家族——TaFIP小麦镰刀菌诱导肽其基因成簇分布于A、B、D三个亚基因组上图1a)。该家族基因具有保守的N端信号肽和C端结构域Fig.1b)在多个小麦品种及玉米、水稻、大麦等单子叶植物中均存在同源序列。转录组数据和RT-qPCR验证一致表明TaFIPs的基础表达水平极低但在禾谷镰刀菌Fg和假禾谷镰刀菌Fp感染后显著上调图1c,d)且其编码蛋白可在感染后的质外体液中被检测到。此外几丁质和flg22等病原相关分子模式PAMPs处理也能快速诱导TaFIP表达并在30–45分钟达到峰值后迅速回落至基础水平(Fig.1e)。这种“快速激活、及时衰减”的表达模式表明TaFIPs参与小麦的基础免疫调控其表达受到严格的时空调控机制约束以避免持续过表达带来的适应性代价。这些发现揭示了TaFIPs作为新型免疫效应分子在作物抗镰刀菌病害中的潜在功能。图1. TaFIP基因簇在镰刀菌侵染及免疫诱导剂作用下呈现上调表达02 H3K4me3与H3K27me3二价标记协同调控TaFIPs表达为解析TaFIP的表达调控机制研究分析了组蛋白修饰的分布特征全基因组分析显示Fg诱导基因——尤其是小肽和受体样激酶——具有显著更高的H3K27me3水平提示H3K27me3在生长状态下维持免疫相关基因的沉默图2a,b。ChIP-qPCR和CUTTag实验证实在未感染条件下TaFIP基因位点同时富集H3K4me3和H3K27me3而H3K36me3和H3K9ac则无此富集图2c,f。动态追踪发现chitin或flg22处理初期H3K4me3水平上升、H3K27me3水平下降Fg或Fp接种也呈现相同的此消彼长模式图2d,e。ReChIP实验直接证明H3K4me3和H3K27me3共存于TaFIP基因座位的同一核小体或相邻核小体上——这正是经典的二价染色质标记bivalent histone marks图2g。而位于TaFIP1-4簇下游的TraesCS4A02G025500基因仅带H3K4me3、不带H3K27me3作为阴性对照验证了特异性。二价标记的动力学变化与TaFIPs的表达曲线完美吻合免疫刺激时H3K4me3升高而H3K27me3下降驱动基因激活刺激撤除后二者恢复基因重回沉默图2h。图2 H3K4me3与H3K27me3协同调控TaFIP簇的表达03 TaSWN介导的H3K27me3是TaFIPs转录抑制的核心为确认H3K27me3的功能因果性研究者先用药物GSK343抑制H3K27me3甲基转移酶处理小麦。长期GSK343处理降低了整体H3K27me3水平使TaFIPs的基础表达升高在chitin、flg22、Fg和Fp诱导下GSK343预处理组的TaFIPs诱导幅度更大、回到基线更慢。这提示H3K27me3是TaFIPs快速关闭的关键。接着研究者锁定了候选甲基转移酶TaSWN编码H3K27me3甲基转移酶在多种组织中表达且在Fg感染后下调。利用已有的Taswn三基因CRISPR敲除突变体ChIP-qPCR和ChIP-seq均证实TaFIPs位点的H3K27me3水平在突变体中显著降低、基础表达升高图3a。与药物实验一致Taswn-cr中chitin和病原菌诱导的TaFIPs表达更强、衰减更慢图3b,c。重要的是Taswn-cr突变体对Fg和Fp的抗性显著增强图3f,g。反向验证来自去甲基酶抑制剂GSK-J1和GSK-J4预处理后TaFIPs的H3K27me3水平升高、chitin/flg22/Fg/Fp诱导的TaFIPs表达被显著削弱图3h-k。这组正反双向实验证明H3K27me3的去除是TaFIPs激活的前提而TaSWN是其沉默的关键酶。图3. TaSWN介导的H3K27me3调控TaFIP簇表达与小麦抗病性04 TaFIPs作为植物细胞因子激活小麦对镰刀菌的免疫应答为检验TaFIPs是否在植物免疫中发挥作用研究者合成了7条成熟肽并在亚纳摩尔尺度上即可诱导小麦MAPK磷酸化激活图4a,b。DAB和NBT染色显示TaFIP处理后H2O2和O2−大量积累图4c。功能上用TaFIP1/2/3预处理小麦可显著增强对Fg和Fp的抗性图4d,e。RNA-seq分析揭示TaFIP3诱导的基因显著富集于防御响应和免疫系统过程包括WRKY转录因子、壁相关激酶、受体激酶等图4f。值得强调的是TaFIPs对小麦幼苗生长影响极小且在体外对Fg和Fp的菌丝生长、产孢和孢子萌发均无直接抑制——说明TaFIPs是通过激活宿主免疫而非直接杀伤病原菌来发挥保护作用。图4.TaFIPs是小麦中针对镰刀菌的免疫调节型植物细胞因子05 受体激酶TaFIPR介导了TaFIPs诱导的免疫应答细胞因子需要被特异性受体识别才能启动信号。由于TaFIPs不能在本氏烟草和拟南芥中触发MAPK激活推测其受体具有物种特异性。从4个Fg诱导的小麦受体激酶中筛选发现TraesCS3D02G276200在异源系统中能使TaFIP1触发MAPK激活命名为TaFIPR-D。TaFIPR-D是一个非典型LRR受体激酶含N端信号肽、23个LRR的胞外域、跨膜域和胞质激酶域定位于质膜图5a-c。它能识别全部7条被测TaFIP肽并触发MAPK激活和FRK1启动子活性而其近缘激酶TaFIRK3则无此功能表明识别具有特异性图5d,e。激酶结构域为RD型激酶D830为活性位点——激酶死突变体D830A丧失自磷酸化能力和MAPK激活能力图5f-i。图5 .TaFIPR介导TaFIP触发的免疫应答06 TaFIPR是TaFIPs的受体为证明直接结合研究用昆虫细胞表达了TaFIPR-D胞外域ECD通过OpenSPR和Biacore SPR测定结合动力学TaFIPR-D ECD与TaFIPs的结合KD在2.62至47.5μM之间与TaFIP3的KD约8.163μM且不与对照肽PEP1结合图6a-d。Pull-down和Co-IP实验进一步证实TaFIPR-D与TaFIP1、TaFIP10在体外和体内均直接相互作用BiFC和LCI实验也验证了这种依赖信号肽的关联图6e-h。图6 .TaFIPR即TaFIP受体07 TaFIPR是小麦TaFIPs介导免疫的必需受体研究者用CRISPR-Cas9构建了Tafipr 三基因敲除突变体。与野生型Fielder相比Tafipr中TaFIP触发的ROS爆发被完全清除RNA-seq显示野生型在TaFIP3处理下有约6,413个差异表达基因而Tafipr中仅471个——免疫转录重编程几乎消失图7a-c。表型上Tafipr对Fg和Fp的感病性显著增强且TaFIPs预处理的保护作用在突变体中完全丧失图7d-f。而过表达TaFIPR-D-OE株系增强了TaFIP诱导的MAPK激活和免疫基因WRKY24、WAK2、RLP6表达对Fg和Fp的抗性也增强激酶死突变体TaFIPR-D D830A-OE则表型与野生型无异图7g-i。这些结果确立了“TaFIPs配体经TaFIPR激酶活性依赖的信号传导最终激活免疫”的因果链。图7 .TaFIPs诱导的免疫应答依赖于小麦中的TaFIPR总 结本文围绕小麦如何表观遗传地精细调控植物细胞因子以平衡免疫与生长这一核心问题展开揭示了“H3K4me3/H3K27me3二价标记经TaSWN介导的H3K27me3沉默、TaFIPs快速转录激活、TaFIPR受体激酶信号传导最终赋予镰刀菌抗性”的完整机制。图8.小麦中TaFIPs介导的抗镰刀菌免疫机制模型